为什么在微孔板阅读器中使用单色仪?

微孔板读卡器在许多科学领域广泛应用于各种方法。有些方法,如发光法,不需要任何波长选择的手段,因为所有的光子都被捆绑在一起来计算样品的发光。然而,大多数方法需要将测量波长限制在窄带宽范围内的能力:例如,测量感兴趣物质的最大吸收附近的吸收,仅激活单个荧光团或分离不同报告蛋白的发射。

 

传统上,滤光片是用来选择所需波长的:由于其高透过率和阻隔性,滤光片价格低廉,使用方便,灵敏度高。然而,它们缺乏灵活性,因为使用不同的波长需要使用不同的过滤装置,它们不适合测量一种物质的光谱。了解更多关于单色的原理和类型

 

单色仪主要用于测定吸光度和荧光强度。

最相关的单色仪标准为微孔板阅读器

光谱范围(波长范围)

市场上许多微孔板读卡器的吸收范围从230 nm到1000 nm。在我们的系统中,您可以使用200纳米的单色仪。当测量荧光时,许多微孔板阅读器只能测量700或740 nm。我们的仪器可以覆盖范围高达850 nm。

 

频谱带宽

光谱带宽(也称为光谱带通)定义为光达到最大值一半处的宽度(半高半宽,简称半高半宽)。狭缝宽度决定了光谱带宽:狭缝宽度越宽,光谱带宽越窄。市场上的许多微孔板读卡器都有固定的光谱带宽。然而,我们的微孔板阅读器,配备了单色仪,都有一个可变的带宽:从4 nm(或6,取决于设备)到22 nm。当激发峰和发射峰非常接近时,较窄的带宽提高了分辨率,推荐用于荧光。更宽的带宽可以提高信噪比。可变光谱带宽的单色仪对于优化复杂的分析非常有用。

屏蔽效率

阻塞效率是指波长选择系统阻塞不需要的波长的能力(除了在单色器中选择的范围),是实现良好信噪比的关键。它表示为离开单色仪的多余光的百分数:阻挡效率为10-3,意味着1/1000多余波长的光没有被阻挡而离开单色仪。大多数微孔板阅读器使用双单色仪配置,以实现10-6的阻塞效率,这是大多数荧光强度分析所需要的。

杂散光

杂散光是在与所选波长不同的波长处离开单色仪的光的测量量。它是由于色散元件或其他光学表面的缺陷、衍射效应、其他光学像差或部件损坏和磨损而产生的辐射。

在吸收测量中,散射光会导致偏离朗伯-比尔定律。在高吸收值时,散射光对吸收与浓度的线性关系有很大的影响。随着浓度的增加,它会产生系统的偏倚,使吸收降低。杂散光也是影响分析线性动态范围上限的主要参数,在荧光测量中也会引起问题。

杂散光表示为出单色仪光的一部分:指数为10-4表示出单色仪光的万分之一是杂散光。

虽然市场上大多数微孔板阅读器的杂散光指数在3 × 10-4到5 × 10-4之间,但Berthold Technologies生产的仪器的杂散光指数达到10-6,即至少高出20倍,在所有基于单色仪的测量中提供最高的可靠性。

光谱分辨率

分辨率是在单色仪中可以设置的最小带通;一旦单色元件及其位置被固定,分辨率就由最小狭缝宽度决定。分辨率对于准确测定样品的光谱至关重要。原来锐利的光谱峰在低分辨率测量时扩大,甚至可能消失使用宽缝宽度;窄缝可以使光谱形状更接近原始光谱。在图1中,您可以看到光谱扫描中分辨率影响的一个例子:当分辨率为4 nm时,500 nm左右的3个峰看起来比1 nm时要平坦,但它们仍然很容易区分;然而,当分辨率为15纳米时,它们似乎融合成一个单峰,导致信息丢失。

在我们的微孔板阅读器中使用的单色仪光谱分辨率为4或6 nm(取决于设备),而许多竞争对手的荧光分辨率仅为9、15甚至20 nm。

图1:光谱分辨率对光谱扫描的影响

什么时候用滤镜测量,什么时候用单色仪测量?

这取决于特定的分析方法。对于一些测量,例如荧光偏振,必须使用滤光片,因为单色仪中的偏振不容易调整。在其他情况下,如BRET,所需的灵敏度将很难用单色仪实现。

一般来说,用滤光片进行的测量比用可比仪器中的单色仪进行的相同测量具有更高的灵敏度。然而,在许多情况下,单色仪提供的灵敏度已经足够好了,而且更大的灵活性和方便性是受欢迎的。

来自Berthold Technologies的基于单色仪的微孔板阅读器提供了两种最好的选择:您可以自由选择过滤器和单色仪,为您的分析提供最佳性能的选择。

我们的单色微孔板阅读器

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