研究蛋白质相互作用的方法

微孔板读数仪是一整套仪器,包括单技术读数仪和多功能读数仪。 微孔板读数仪相对于其他可测量PPI技术的仪器的主要优势在于,它们可以在相对较短的时间内测量许多样品。 所有读数仪都可以测量96孔微孔板,有些还可以测量384孔和1536孔板。 由于采用了光电倍增管,它们对荧光和发光测量均具有出色的灵敏度,因为PMT甚至可以检测到最小量的光子。 与共聚焦显微镜等成像系统和体内成像系统相比,微孔板读数仪几乎没有提供相互作用的定位信息。

配备合适滤光片的简单吸光度微孔板读数仪通常足以量化酵母双杂交和分裂泛素系统中使用的生色酶的活性。 基于光栅的光吸收读数仪也非常适合此应用。

任何板式或管式发光仪都可以用于定量分裂荧光素酶互补分析过程中的发光。 对于BRET分析,应使用多功能读数仪,因为它们可以配备必要的滤光片以区分受体和供体的发射。 也可以使用光栅进行BRET分析,但灵敏度远低于使用滤光片时的灵敏度,因此不建议使用。 

FRET和双分子荧光互补剂(BiFC)均可使用配有合适滤光片的任何荧光微孔板读数仪进行测量。 由于FRET的光谱范围非常宽,因此建议在仪器的光谱范围内测试波长大于600 nm的荧光染料,因为在某些读数仪中,光谱范围可选择扩展到850或900 nm 。 与BRET一样,使用滤光片时的FRET性能通常要优于光栅。

现代微孔板读数仪能够测量TR-FRET是很常见的,它是一个可选功能,在低端或较旧的仪器中可能会没有这个功能。 但是,在设置中几乎不使用术语TR-FRET替代TRF(时间分辨荧光)。 从仪器的角度来看,TR-FRET测量只是两个TRF测量的组合。 一个是供体,一个受体。 使用滤光片而不是光栅进行TR-FRET测量也具有更好的性能,仪器的光谱范围必须能够测量所有涉及的荧光染料,因为在某些TR-FRET分析中通常在665 nm处进行测量。

荧光寿命测量需要非常特殊的硬件,在任何多功能读数仪中均无法使用。 过去,包括Tecan和伯托公司在内的主要制造商提供了几种不同的仪器,但其中大多数已停产,并且目前唯一具有荧光寿命功能的微孔板读数仪是荧光创新公司的NovaFluor PR。

伯托公司为PPI研究推荐的微孔板读数仪

方法Apollo 11 LB 913Centro LB 963Tristar 3Tristar 5

酵母双杂交系统

    

分裂泛素系统

    
FRET (SE FRET)    
TR-FRET    
BiFC    

荧光寿命成像显微镜-荧光共振能量转移(FLIM-FRET)

    

分裂荧光素酶互补分析 

    
BRET