基于吸光度

260 nm紫外分光光度法

几十年来,吸光度一直是常规DNA和RNA定量的方法。 使用简单方便,因为不需要进一步的样品处理(除了DNA提取),也不需要与其他物质发生反应。 但是,它不是很特异性(它整体上测量所有核酸)并且对污染物敏感,因此它需要非常纯净的DNA才能准确。 了解有关DNA纯度,如何测量及其影响定量的更多信息。

目前最常使用微量分光光度计测量260 nm处DNA样品的吸光度,但也可以使用比色皿分光光度计或微孔板读数仪

在这种方法中,物质的浓度是根据比尔-朗伯定律基于其吸光度来计算的,得出以下公式:

The formula of the Beer-Lamber law

公式中A =在给定波长处的吸光度,ε =消光系数,b =分光光度计的路径长度,c =样品的浓度。因此,对于1cm的路径长度,浓度等于260nm处的吸光度(核酸的吸收峰)除以消光系数。

DNA浓度计算公式

dsDNA的消光系数为0.02(µg/mL)-1 cm-1

Recommended formula to calculate the concentration of DNA using absorbance

相同的公式也可以使用ssDNA(吸光度x 37 µg / mL)和ssRNA(吸光度x 40 µg / mL)的消光系数。 需要注意的是,该公式仅对所有核苷酸中具有相似比例的大核酸分子有效,例如基因组DNA和质粒。 对于寡核苷酸和其他短核酸分子(例如miRNA),消光系数必须根据寡核苷酸的序列进行计算。

二苯胺法(迪氏试验)

通过吸光度定量DNA的另一种方法是二苯胺法,该方法基于二苯胺与脱氧核糖形成蓝色络合物的反应。 该方法耗时,灵敏度低,因此在大多数实验室中不再使用。 使用标准ELISA读数仪在595 nm处进行测量。